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Seminario Influenza aviar en Uruguay: vigilancia y secuenciación genómica
El miércoles 24 de mayo en el marco de la Semana de la Ciencia se realizó en la Facultad de Ciencias de la Universidad de la República (Udelar) el Seminario Influenza aviar en Uruguay: vigilancia y secuenciación genómica.
El Seminario estuvo a cargo de la División Laboratorios Veterinarios (DILAVE) del Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca (MGAP), el Área de Fauna del Ministerio de Medio Ambiente e investigadores de la Facultad de Ciencias de la Udelar y específicamente del Grupo de Genética de Microorganismos. En el evento se presentaron resultados de la vigilancia para influenza aviar en Uruguay por parte de los organismos oficiales y se discutieron los resultados de las primeras secuencias genómicas obtenidas a partir de brotes uruguayos. Los expositores fueron Sirley Rodríguez del Departamento de Virología del DILAVE, Yanina Panzera, Ana Marandino, Gonzalo Tomás y Ruben Pérez de Facultad de Ciencias de la Udelar y Carmen Leizagoyen del Ministerio de Ambiente.
Tecnología y metodologías de secuenciación
Panzera, integrante del Grupo de Genética de Microorganismos liderado por el docente Rubén Pérez, destacó el rol que tuvo en la investigación, la Plataforma Genómica de la Facultad de Ciencias. Se trata de una infraestructura fundada a fines de 2018 que cuenta con todo el equipamiento necesario (equipos de tecnología Illumina de secuenciación masiva de segunda generación y equipos de secuenciación masiva de tercera generación) lo que posibilitó realizar la secuenciación completa genómica de algunos de los brotes de influenza que ocurrieron en Uruguay.
Resaltó que si bien la plataforma recibió el apoyo de distintas entidades, la mayor parte de los fondos para financiar esta plataforma provino de la Comisión Sectorial de Investigación Científica (CSIC), de la Udelar. También señaló el apoyo de la empresa Biko que colaboró permanente con la Plataforma y suministró algunos equipos muy importantes como un homogeneizador de tejidos (matrices, muestras biológicas) y un equipo automatizado de extracción de ácidos nucleicos. Destacó que esos equipos son muy importantes para los investigadores porque les permiten estandarizar las metodologías que aplican y que estas sean más reproducibles. Asimismo esta empresa se ha comprometido a apoyar en un par de meses a la Plataforma para que esta pueda cambiar el equipo Illumina con el que cuenta, un MiniSeq que es muy pequeño, por otro de mayor nivel, lo que significará un salto cuantitativo y cualitativo para la Plataforma.
Las metodologías de secuenciación de ácidos nucleicos permiten determinar el orden exacto de las bases nitrogenadas en una molécula de ADN. Todas estas tecnologías han avanzado a lo largo de la historia con un objetivo muy claro: obtener más datos de secuencia en menor tiempo, lo que implicó una baja de costos enorme en la secuenciación. La relevancia de la secuencia Illumina dentro de estas metodologías radica en que brinda una gran robustez en la secuencia que construyen los investigadores porque le da una alta profundidad de cobertura, es decir leen miles de veces una misma posición nucleotídica, lo que les permite identificar con certeza cada base.
El equipo MiniSeq con el que cuenta la Plataforma es capaz de devolver 7.5 GB de información (75000 millones de bases de información). Asimismo la tecnología Illumina permite analizar cualquier matriz biológica, un tejido, una superficie, agua potable o residual. Además todas las moléculas contenidas en esa matriz o muestra biológica, independientemente de que sean conocidas o no para los investigadores, van a ser secuenciadas por el equipo. Para realizar esta secuenciación, que se lleva a cabo en un pequeño soporte sólido, los investigadores hacen una extracción de ácidos nucleicos y les aplican una serie de modificaciones que permiten que el equipo lleve a cabo la secuenciación. Estos cambios consisten en fragmentar las moléculas mayores en otras de pequeño tamaño y luego adicionarle en el extremo ciertas modificaciones.
Todas las moléculas de la muestra biológica que fueron modificadas previamente fluyen hacia el soporte sólido se adhieren a este y son amplificadas para que a la hora que ocurra la síntesis la secuenciación se haga por un proceso de polimerización y al adicionar los nucleótidos copiándolos de una hebra molde, estos están marcados con flopóforos, emiten luz de determinado color de tal modo que al amplificarlo el equipo puede detectar la señal que se emite durante el proceso de síntesis. «Se incorpora un nucleótido, se emite una luz y esa luz es amplificada a una base, cada base emite un color y entonces al final del proceso terminamos obteniendo nuestra secuencia», apuntó Panzera.
Vigilancia sanitaria
Sirley Rodríguez hizo uso de la palabra en representación del Departamento de Virología de DILAVE que es el laboratorio oficial del MGAP en el área veterinaria. Explicó que el servicio oficial del Ministerio, lleva adelante una tarea de vigilancia y diagnóstico de influenza aviar. Por ley este servicio del MGAP tiene el cometido exclusivo de actuar como policía sanitaria en todas esas enfermedades que se encuentren bajo campaña o sean exóticas. La vigilancia que lleva adelante el Ministerio frente a cualquier enfermedad, consta de dos ramas: una vigilancia de tipo activa y otra de tipo pasiva.
La vigilancia pasiva es toda aquella información que el MGAP recibe que no está pautada, se vincula con notificaciones de sospechas de presencia de casos de la enfermedad que pueden provenir de productores, reservas u organizaciones no gubernamentales que observan un episodio de mortandad de aves. Estas informaciones son insumos con los que el Ministerio trabaja también para obtener datos con los que elaborar el estatus sanitario de cualquier enfermedad. En lo que se refiere a este tipo de vigilancia, el equipo del Ministerio se encarga de realizar el control de la importación de material genético de Brasil o Argentina ya que no se produce en el país. Cada vez que ingresa al territorio una partida de pollitos bebés desde estos países, siempre el Ministerio toma muestras de estas aves, que se envían para realizar análisis de Influenza y Newcastle.
Ante la aparición de los primeros casos de Influenza aviar en Argentina, en el control que se realiza a las aves que provienen de este país, se cambió de la técnica de análisis de aislamiento, que llevaba 7 días como mínimo, a la de PCR a través de la cual se demora mucho menos tiempo en obtener los resultados. En breve se prevé que se estará haciendo lo mismo con las importaciones provenientes de Brasil ya que en este país ya se está hablando de la cercanía de la aparición de los primeros casos.
Otra línea de la vigilancia pasiva es la certificaciones sanitarias que el MGAP realiza de importaciones o exportaciones de aves vivas. En estos casos se realiza el análisis establecido en la resolución, si el país comprador establece que se debe comprobar con un PCR o con aislamiento, que las aves estén libres de estas enfermedades, se les realiza el tipo de análisis solicitado. De la misma manera en el caso de las importaciones de aves, más allá de que estas vienen con certificaciones, generalmente el Servicio del MGAP indica que permanezcan en cuarentena para estar seguros que no están infectadas.
Entre el 2022 y el 2023 han incorporado otro tipo de vigilancia que no realizaban normalmente que se vincula con contrabando, el movimiento de aves ilegales vivas que previo a su relocalización en otro lugar, son testeadas para descartar la presencia de los virus de Influenza y Newcastle.
La vigilancia activa es aquella en la que el organismo público realiza un diseño de muestreos, a los que se denomina muestreos activos. Es un proceso planeado, instituido, que busca determinar presencia o ausencia de la enfermedad que se está vigilando, en el cual se elige qué tipo de muestras se van a tomar, a qué categorías está dirigido el muestreo, entre otras condiciones del estudio. Recordó que hace más de 20 años que el MGAP lleva adelante la vigilancia para dos infecciones con las que trabaja en forma conjunta: la influenza y el Newcastle, el muestreo que se realiza para una ya sirve para la otra infección.
Para este trabajo planificado de muestreo se apunta a abarcar todos los extractos de aves existentes como el comercial que incluye las ponedoras, los parrilleros y las reproductoras. Otras de las aves que se estudian son las de traspatio, que son todas aquellas aves que están fuera de un control porque pertenecen a establecimientos no registrados o gallineros domésticos. Asimismo se realiza la vigilancia pasiva de aves silvestres, recordó que hace un tiempo atrás se realizó un muestreo activo de este tipo de aves pero es un proceso muy costoso, se necesita personal entrenado, por lo que se quedaron solo con la vigilancia pasiva en este extracto de aves.
En cuanto al procedimiento de los muestreos que realizan, estos pueden ser aleatorios o basados en riesgos. Asimismo pueden ser de dos tipos: virológicos o serológicos. Se buscan anticuerpos para determinar si hubo circulación o se indaga si hay presencia de virus. En 2022 cuando se alertaba acerca del posible ingreso al país del virus de la influenza aviar y el equipo de investigadores del Ministerio se estaba preparando para esta eventualidad, epidemiología señalaba que era necesario realizar un muestreo más dirigido hacia las zonas de mayor riesgo como los Humedales de Rocha y la zona de costas de este departamento donde existe presencia de aves migratorias, sin dejar de vigilar lo más importante que es toda la zona avícola que en Uruguay se encuentra concentrada entre los departamentos de Canelones, San José y una parte en Montevideo rural.
Asimismo se plantearon una vigilancia en el litoral oeste donde se desarrolla alguna producción avícola y que tiene frontera con zonas de Argentina donde también se lleva adelante esta forma de producción. Ante un caso sospechoso para el diagnóstico se puede utilizar la serología o la detección viral a través de una prueba que se realiza «al pie del ave» con un antígeno rápido. Cuando un animal es diagnosticado positivo todo el predio se considera infectado.
Influenza aviar en Uruguay
Rodríguez recordó que en el año 2021 en el marco de la vigilancia activa se realizaron aproximadamente 1167 muestras de sueros y el mismo número de hisopados, dirigidos a granjas reproductoras y de traspatio y se atendieron cinco casos de sospechas. En 2022 se realizó un muestreo que abarcó 1057 muestras tanto de hisopos como de sueros, abarcó todos los tipos de aves de los extractos comerciales (parrillero, ponedoras y reproductoras) y de traspatio. En la actualidad ante la aparición de los primeros casos de Influenza aviar en países limítrofes, se incrementan las sospechas, hasta mediados de mayo se registraron 158 casos de sospechas, por lo que el MGAP está realizando charlas a los productores y guardaparques.
El 13 de febrero de 2023 el Servicio de Rocha del MGAP es notificado por los guardaparques que se estaba registrando una alta mortandad de cisnes de cuello negro en la Laguna Garzón. Los técnicos del Ministerio concurren, constatan que hay muerte de las aves y toman muestras que se envían al laboratorio donde se les realiza PCR, dando positivo para la Influenza y para el virus H5 en el linaje euroasiático y el norteamericano.
Inmediatamente se declara la alerta sanitaria como se hace frente a toda enfermedad exótica y se dan los pasos correspondientes dispuestos ante esta eventualidad como la comunicación de esta alerta a la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) a la que Uruguay está afiliado. Además se estableció un radio de 5 a 10 kilómetros en torno al foco detectado, zona en la que, aunque había muy poca producción avícola, existían aves de traspatio, por lo que se llevó adelante una vigilancia sanitaria que incluyó toma de datos y muestras, con lo que se logró que el virus quedara localizado en esa zona y no pasara a otras. En cuanto a las acciones que se siguieron con las aves silvestres, Rodríguez señaló que lo único que se puede hacer es enterrarlas para bajar la carga viral y evitar que depredadores o incluso seres humanos sean difusores de ese virus. Acotó que se mantiene una vigilancia sanitaria de la zona con drones para verificar lo que sucede especialmente con los cisnes negros y si migran hacia otras regiones.
Otro de los casos se dio a pocos días del anterior en San Gregorio de Polanco donde se notifica de una alta mortandad de aves en un predio de traspatio. La mortandad de aves en este caso afectó a una multiplicidad de especies, entre ellas gallinas de guinea, patos, gallinas comunes, aves migratorias, algo que en Uruguay ha sido una constante en los traspatios que han dado positivo a la Influenza y 5 de ellas para el H5 linaje euroasiático. En este caso también se tomaron muestras que dieron positivas al virus y se pudo localizar el virus evitando que se expandiera a otras zonas.
